Protein의 Glycosylation

전에 같이 근무하던 직원에게 오랜만에 전화가 왔습니다. CMO 위탁을 받아 고객사의 항체 의약품을 제조하고 있는데, 항체 의약품의 Sialic Acid의 함량이 낮다고 고객사에서 문제를 제기하고 있어서 골치 아프답니다. 

아~ 맞다! 제가 최근에 백신 제조업체에 근무하고 있어서 항체 의약품 공정에 대해 잠시 잊고 있었습니다. 항체 의약품에서 제일 큰 문젯거리가 무엇인 줄 아세요? 바로 항체의 Glycosylation Pattern입니다. 이 Glycosylation이라는 것이 단백질이 Translation 후 단백질에 당이 붙는 것이거든요. 그래서 Post-Translational Modification이라고 하고요, 생산 Host를 수율이 높은 미생물을 이용하지 못하고 생산단가도 높고, 기간도 길고, 수율도 낮은 동물세포를 이용하는 제일 큰 이유입니다.

Glycosylation이 제대로 안 된 항체는 우리 몸에서 내 것으로 인식하지 않고 외래물질로 인지하기 때문에 바로 없애버리기 때문에 치료 효과가 없거든요. 그리고 당 Pattern에 영향을 미치는 요인 중 명확히 밝혀지지 않은 요인이 많기 때문에 많이들 어려워합니다. Biosimilar 분야에서는 더 어려워하죠. Original 의약품과 Polypeptide Sequence를 동일하게 하는 것은 당연하고 어렵지 않지만 당 Pattern은 100% 동일하게 한다는 것은 거의 불가능하거든요.

일단, 영어로 된 동영상이지만 들리는 단어만 들으면서 한번 보세요. 단클로항체 의약품의 Biosimilar Characterization에 대한 내용입니다. 생화학, 면역학, 분석의 종합판입니다. 저도 잘하지 못하는 영어지만 대면 수업 때 대강 해석해 드리도록 하겠습니다.

youtu.be/aOFIyydHMoo

그래서 오늘은 당단백질의 Glycosylation에 대해 알아보도록 하겠습니다. 

그 전에 비공전자인 분들을 위해 Protein과 당(Saccharide)에 대해 잠깐 알아보겠습니다.

Protein의 경우 XXX 교수님 수업을 통해 많이 알고 계시죠? 20종의 Amino acid가 Peptide bond로 결합된 Polymer 이고 Amino acid의 Peptide Backbone의 곁가지로 나와 있는 Amino acid 종류에 따라 다른 R-group의 특징으로 사슬 내에서 서로 결합하여 3중 구조를 이루고 있다는 것을요….

그럼 Saccharide에 대해서는 문과생들도 포도당이다 뭐다 단편적으로는 알고 계실 겁니다. 우리가 주로 먹는 밥과 밀가루의 주성분은 녹말 또는 전분입니다. 이 전분을 영어로 Starch라고 하고, 이 Starch는 Polysaccharide, 즉 다당체입니다. Polysaccharide는 포도당과 같은 단당류들이 Glycoside bond 등으로 서로 이어져 있는 형태입니다.

아래가 Starch의 구조입니다. 육각형 하나가 포도당(Glucose) 이고요. 우리가 밥이나 라면을 먹으면 우리 소화효소가 이 Glucose들을 연결하고 있는 Glycoside bond를 끊고 단당인 포도당으로 만들고, 포도당은 Glycolysis Pathway를 거쳐 분해되면서 우리에게 에너지를 줍니다.

 

다른 Polysaccharide인 Cellulose도 Starch와 동일한 Glucose의 중합체인데요, 다른 점은 Glucoside bond와 수소결합으로 연결되어 있어서 우리 소화효소로는 끊지 못합니다. 그래서 우리는 소화를 못 시키지만 소나 염소의 소화효소로는 이 결합을 끊을 수 있기 때문에 걔네들은 풀도 잘 먹습니다.

이렇게 Polysaccharide를 이루는 단위체인 단당류 (Monosaccharide) 는 Glucose만 있는 것이 아닙니다. Fructose, Galactose, Xylose, Lactose, Mannose, Sialic Acid (N-acetylneuramic Acid) 등 다양합니다.

이런 당류는 Polysaccharde와 Monosaccharde만 있는 것은 아니고, 다양한 형태로 존재하는데요… 2개 당으로 이루어진 disaccharide, 대여섯 개로 이루어진 oligosaccharide 등 다양합니다.

Saccharide에 대해서는 여기까지… 식품 분야 전공하신 분들은 저보다 훨씬 전문적으로 알고 계실 것 같습니다. 틀린 부분 있으면 짚어 주세요. 하지만 이 정도만 알고 있어도 회사생활에는 큰 문제 없을 것 같습니다.

그럼 본론으로 들어가지요.

Monoclonal antibody를 포함하여 약 70%의 치료용 단백질은 Glycoprotein (당 단백질) 입니다.  그만큼 바이오의약품에서는 단백질의 Glycosylation이 중요합니다. 
Glycoprotein은 단백질에 Polysaccharide (Glycan. Glycoprotein, Glycolipid 같이 어떤 다른 물질에 붙어 있는 Polysaccharide를 특별히 Glycan이라고 합니다.) 가 붙어있는 단백질을 말합니다. 
Glycosylation은 단백질의 Polypeptide backbone에 여러개의 Glycan들이 붙는 과정으로 단백질의 post-translational modification 중 가장 복잡하고 에너지가 많이 소비되는 과정입니다. 이 Glycosylation이 중요한 이유는 바이오의약품의 Pharmacokinetics와 Pharmacodynamics에 굉장히 중요한 영향을 미치게 됩니다.

(Pharmacokinetics(PK, 약물동태학): 약물의 흡수, 분포, 대사, 생체 내 변화, 배설과정을 연구하는 학문이고요, Pharmacodynamics(PD, 약물동력학): 약물에 의한 생체의 생리학적, 생화학적 작용과 그 작용기전 즉 약물이 일으키는 생체의 반응을 연구하는 학문입니다)

앞에서도 말했듯이 치료용 단백질의 불완전하거나 부정확한 Glycosylation은 혈액내에서 빠르게 제거됩니다. 이 Glycosylation은 단백질의 Stability (Protease, pH, chemicals, 온도에 대한 민감성), 용해도와 Aggregation에도 많은 영향을 줍니다.

Glycoylation은 크게 N-linked Glycosylation과 O-linked Glycosylation이 있습니다. 

O-linded Glycosylation은 단백질을 구성하는 amino acid 중 Threonine이나 Serine의 R group의 Hydroxyl group (-OH) 내 Oxygen에 당이 Carbohydrate bond로 결합합니다. 
치료용 단백질에서 주로 발견되는 Glycosylation type의 N-linked Glycosylation이기 때문에 여러분은 O-linked Glycosylation은 모르셔도 됩니다. 

N-linked Glycosylation은 Asn-X-Ser/Thr 의 Polypeptide Sequence에서 Asparagine의 Amino group (-NH2)의 Nitrogen에 Carbohydrate Bond로 Glycan이 결합된 형태입니다. 

아래 그림에서 (a)가 O-linked 이고 (b)가 N-linked 입니다.

 

치료용 Glycoprotein 은 사람의 N-linked Glycoprotein과 비슷하고, Homogeneous (일정한 Pattern을 가진)해야 합니다. 이러한 Glycoprotein을 얻기 위해 다음 3가지의  Glycoengineering Stragege가 있을 수 있습니다.

- Cellular Glycosylation Pathway 조작 
예: 특정 Glycosylation에 관여하는 Enzyme을 knockout : FUT8 gene (Fucosyltrasferase enzyme을 발현하는 gene)을 Knockout 시킨 mutant CHO cell 이용 → defucosylated antibody 생산 → Antibody dependent cell mediated cytotoxicity activity를 이용한 암치료 효과 개선

- 단백질의 Glycosylation site 변경

- Glycoprotein 생산 후 N-glycan에 화학적 또는 Enzymatic Modification 실시

 

대부분의 치료용 Glycoprotein은 동물세포를 기반으로 제조되나, 생산되는 Glycan의 Heterogeneity가 최대의 문제점입니다.  예를 들면 CHO cell을 이용한 EPO (Erythropoietin)의 80% 가량이 부정확한 Glycosylation 때문에 버려진다고 합니다. 
동물세포의 Glycoform Profile은 공정에 이용하는 Cell Type (CHO, NS0, SP2/O, PER.C6), 배지와 Bioprocess에 많은 영향을 받는 것으로 조사되어 있습니다. 일반적으로 Bioprocess Control을 통해 일정한 Glycosylation Pattern을 얻으려는 시도를 많이 하고 있습니다.

Yeast는 30g/L에 달하는 높은 생산성과 Post-translation을 할 수 있기 때문에 매력적인 Glycoprotein 생산 Host입니다. 하지만 위 그림에서 보듯이 Yeast의 N-linked Glycosylation은 많은 비율의 Mannose를 가지고 있기 때문에 간의 Mannose Receptor와 Asialoglycoprotein(사람의 Glycoprotein에서 맨 끝단의 Sialic Acid가 제거된 Glycoprotein) Receptor에 Binding해서 in-vivo Half-Life가 매우 짧아지는 문제점이 있습니다. 그리고 이 α(1,3)-linked mannose side chain Glycan은 Immunogenic해서 부작용이 큽니다. (개인적인 생각으로는 Vaccine의 Adjuvant로 개발하면 좋을 것 같습니다). 

GycoFi사는 앞에서 언급한 Glycoengineering을 통해 P.pastoris을 이용한 Homogeneous Human-like Glycoprotein 생산에 성공했고 2006년에 Merch에 인수합병 된 경우도 있습니다.

Insect Cell이나 Plant Cell, 심지어 Bacteria를 이용한 Human-like Glycoprotein 생산을 연구가 계속 진행중입니다만, 동물세포에 비해 큰 장점이 없거나, 기술적으로 아직 극복해야 할 문제점이 많아 쉽지 않아 보입니다.